3/1:20818

2.8.18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНА В

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ. Афлатоксины относятся к высокотоксичным и канцерогенным

веществам. По возможности все манипуляции проводят в вытяжном шкафу. Вследствие

электростатических свойств токсинов в сухом виде и их склонности к распространению по

всей рабочей поверхности, при работе с ними принимают особые меры предосторожности,

например, используют закрытый бокс, оснащенный перчатками-манипуляторами. Процедуры

деконтаминации лабораторных отходов, содержащих афлатоксины, предложены

Международным агентством по изучению рака (International Agency for Research on Cancer,

IARC).

Афлатоксины являются микотоксинами природного происхождения, продуцируемыми в

основном Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus. Эти грибы широко распространены в

природе и наиболее часто встречаются в случае произрастания некоторых видов злаков в

стрессовых условиях, например, засухи. Плесневый грибок встречается в почве, гниющей

растительности, сене и зернах, склонных к загрязнению микроорганизмами, и поражает все

типы органических субстратов при любых условиях, благоприятствующих ее росту.

Благоприятные условия включают высокую влажность и высокую температуру. Известно

как минимум 13 различных природных типов афлатоксинов, большинство из которых

является высокотоксичными и канцерогенными. Наиболее токсичным считается афлатоксин

В1. Лекарственное растительное сырье, склонное к контаминации афлатоксинами,

испытывают по валидированной методике.

Представленная в данной общей фармакопейной статье методика подходит для определения

содержания афлатоксина В1 в имбиря корневищах, сенны плодах и гарпагофитума корнях.

Для определения афлатоксинов в лекарственном растительном сырье или растительной

фармацевтической субстанции можно использовать данную методику, если доказана ее

пригодность, или используют другую валидированную методику. Содержание афлатоксина

В1 должно составлять не более чем 2 ppb при отсутствии других указаний в частной

фармакопейной статье. Также уполномоченным органом может быть установлено

предельное содержание суммы афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 не более 4 ppb.

Приведенные методы не предназначены для включения в частные монографии на

лекарственное растительное сырье в качестве методов количественного определения

аристолохиевых кислот, образующихся в растительном сырье как вторичные метаболиты.

Для этого необходимы более чувствительные и валидированные методы.

МЕТОДИКА

Жидкостная хроматография (2.2.29).

Афлатоксины при воздействии света распадаются. Испытание проводят в помещениях,

защищенных от дневного света: на оконные стекла наносят УФ-защитную пленку в

сочетании с приглушенным светом или занавешивают окна шторами или жалюзями в

комбинации с искусственным освещением (подходят флуоресцентные лампы). Растворы,

содержащие афлатоксины, защищают от дневного света.

Всю посуду перед использованием ополаскивают 10 % (об/об) раствором серной кислоты Р

и затем тщательно промывают водой дистиллированной Р до отсутствия следов кислоты

(проверяют с помощью индикаторных полосок для определения pH).

Испытуемый раствор. Используют иммуноаффинную колонку, содержащую антитела к

афлатоксину В1 с емкостью не менее 100 нг афлатоксина В1 и обеспечивающую

открываемость (выход) не менее 80 % при прохождении через нее раствора 5 нг афлатоксина

В1 в смеси из 12.5 мл метанола Р и 87.5 мл воды Р. К 5.00 г измельченного испытуемого

образца (500) (2.1.9.30) прибавляют 100.0 мл (V1) смеси 30 объемов воды Р и 70 объемов

метанола Р и экстрагируют при воздействии ультразвука в течение 30 мин. Фильтруют

через складчатый бумажный фильтр. 10.0 мл (Vi) прозрачного фильтрата переносят в

коническую колбу вместимостью 150 мл и прибавляют 70 мл воды Р. 40.0 мл полученного

раствора пропускают через иммуноаффинную колонку, имеющую температуру от 15 °C до

25 °C, со скоростью 3 мл/мин (скорость не должна превышать 5 мл/мин). Колонку дважды

промывают водой Р порциями по 10 мл со скоростью, не превышающей 5 мл/мин, и

высушивают с использованием слабого вакуума в течение 5–10 с или пропусканием через

колонку воздуха с использованием шприца в течение 10 с. В колонку вносят 0.5 мл

метанола Р и дают растворителю пройти через колонку под действием силы тяжести. Элюат

собирают в мерную колбу вместимостью 5 мл (V2). Через 1 мин вносят вторую порцию

метанола Р объемом 0.5 мл, а еще через 1 мин вносят третью порцию метанола Р объемом

0.5 мл. Собирают элюат при помощи пропускания через колонку воздуха или при помощи

вакуума. Объединенные элюаты доводят водой Р до объема 5.0 мл и тщательно

перемешивают. Если полученный раствор прозрачный, он может быть использован для

дальнейшего испытания. В случае получения непрозрачного раствора, его пропускают через

мембранный фильтр (например, политетрафторэтиленовый фильтр с номинальным размером

пор 0.45 мкм), который не удерживает афлатоксины.

Первичный основной раствор афлатоксина В1. Афлатоксин В1 Р растворяют в смеси из 2

объемов ацетонитрила Р и 98 объемов толуола Р для получения раствора с концентрацией

10 мкг/мл. Для определения точной концентрации афлатоксина В1 в основном растворе

снимают спектр поглощения (2.1.2.24) в диапазоне длин волн от 330 нм до 370 нм с

использованием кварцевых кювет. Концентрацию афлатоксина В1 в микрограммах на

миллилитр рассчитывают по формуле:







100

где:

D – оптическая плотность в максимуме полученного спектра;

М – молярная масса афлатоксина В

(312 г/моль);

ɛ – молярный коэффициент поглощения афлатоксина В

в смеси толуол Р –

ацетонитрил Р (1930 м

/моль);

l – длина оптической пути (кюветы - 1 см).

Вторичный основной раствор афлатоксина В1. Вторичный основной раствор, содержащий

100 нг/мл афлатоксина В1, готовят разведением первичного основного раствора афлатоксина

В1 смесью ацетонитрил Р – толуол Р (2:98 об/об). Колбу с содержимым тщательно

обертывают алюминиевой фольгой и хранят при температуре ниже 4 °С. Перед

использованием содержимого колбы алюминиевую фольгу не удаляют, пока содержимое не

достигнет температуры от 15 °С до 25 °С. Если раствор хранится в течение длительного

периода времени (например, 1 мес.), взвешивают колбу с содержимым и записывают массу

перед и после каждого использования раствора.

Стандартные растворы афлатоксина В1. В мерные колбы вместимостью 250 мл помещают

объемы вторичного основного раствора афлатоксина В1, указанные в таблице 2.8.18.-1.

Пропускают поток азота при температуре от 15 °С до 25 °С до практически полного

испарения растворителя. В каждую колбу прибавляют 75 мл метанола Р, дают афлатоксину

В1 раствориться и доводят водой Р до объема 250.0 мл.

Таблица 2.8.18.-1. – Стандартные растворы афлатоксина В

Стандартный

раствор

Объем вторичного

основного раствора

(мкл)

Конечная концентрация

стандартного раствора (нг/мл)

125

0.05

250

0.1

500

0.2

750

0.3

1000

0.4

Калибровочный график. Строят калибровочный график зависимости сигнала от

концентрации афлатоксина B1 (в нанограммах на миллилитр) в стандартных растворах 1 – 5

(охватывает диапазон, эквивалентный содержанию афлатоксина B1 в испытуемом образце 1–

8 ppb) и проверяют его линейность. Если содержание афлатоксина B1 в испытуемом образце

выходит за пределы калибровочного диапазона, испытуемый раствор должен быть разведен

до достижения подходящей концентрации.

Условия хроматографирования:

– колонка: длиной 0.25 м и внутренним диаметром 4.6 мм, заполненная силикагелем

октадецилсилильным для хроматографии Р с размером частиц 5 мкм;

– подвижные фазы:

– подвижная фаза А (для постколоночной дериватизации с фотохимическим реактором или

пиридиния бромидом): ацетонитрил Р – метанол Р – вода Р (2:3:6 об/об/об);

– подвижная фаза В (для постколоночной дериватизации с бромом, получаемым

электрохимически): 0.12 г калия бромида Р и 350 мкл азотной кислоты разбавленной Р1

прибавляют к 1 л подвижной фазы А;

– скорость подвижной фазы: 1 мл/мин;

– детектор: флуоресцентный; рекомендуемые настройки – 365 нм (длина волны

возбуждения) и 435 нм (длина волны эмиссии);

– объем вводимой пробы: 500 мкл.

Условия постколоночной дериватизации с пиридиния гидробромидом пербромидом:

– безимпульсный насос;

– тройник с нулевым мертвым объемом;

– политетрафторэтиленовая реакционная трубка длиной 0.45 м и внутренним диаметром 0.5

мм;

– подвижная фаза А;

– постколоночный дериватизирующий реактив: 50 мг пиридиния гидробромида пербромида

Р растворяют в 1000 мл воды Р (хранят с защитой от света и используют в течение 4 сут);

– скорость потока дериватизирующего реактива: 0.4 мл/мин.

Условия постколоночной дериватизации с использованием фотохимического реактора:

– реактор с одной ртутной ультрафиолетовой лампой низкого давления с максимальной

интенсивностью при длине волны 254 нм (мощностью не менее 8 Вт);

– полированная пластина-держатель;

– витой реактор: политетрафторэтиленовая трубка, плотно намотанная вокруг

ультрафиолетовой лампы, длиной 25 м, внутренним диаметром 0.25 мм и номинальным

свободным объемом 1.25 мл;

– время экспозиции: 2 мин;

– подвижная фаза А.

Условия постколоночной дериватизации с бромом, получаемым электрохимически:

– электрохимическая ячейка, генерирующая реактивную форму брома для дериватизации

афлатоксинов, выражающуюся в усилении флуоресценции; доступна из разных

коммерческих источников;

– источник постоянного тока, соединенный с электрохимической ячейкой, дающий

постоянный ток в 100 мкА;

– политетрафторэтиленовая реакторная трубка длиной 0.12 м, внутренним диаметром 0.25

мм;

– подвижная фаза В.

Порядок элюирования веществ: афлатоксин G2, афлатоксин G1, афлатоксин B2, афлатоксин

B1.

Расчеты. Рассчитывают уравнение линейной зависимости вида y=ax+b. Концентрация

афлатоксина В1 в испытуемом растворе равна 𝑆−𝑏𝑎, где S – измеренный сигнал для

испытуемого раствора.

Содержание афлатоксина B1 в испытуемом образце (в ppb) рассчитывают по формуле:

CVV





где:

m – масса навески испытуемого образца, в граммах;

– объем растворителя, использованный для экстракции, в миллилитрах;

– объем раствора, взятый для иммунноаффинной очистки, в

миллилитрах;

– объем раствора после элюирования с иммунноаффинной колонки и

разведения в миллилитрах;

C – найденная концентрация афлатоксина В

, в испытуемом растворе, в

нанограммах на миллилитр.

Присутствие афлатоксина В

в испытуемом образце может быть подтверждено с

помощью хроматограмм без постколоночной дериватизации, но следует учесть, что

это приводит к значительному снижению сигнала афлатоксина В

(более чем в 10 раз).